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基因擴增PCR儀每個循環的三個基本反應步驟分享

發布時間:2022-02-23瀏覽:109次

  基因擴增PCR儀是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法,由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應組成一個周期,循環進行,使目的DNA得以迅速擴增,具有靈敏度高、特異性強、操作簡便、省時等特點。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎研究,還可用于疾病的診斷或任何有DNA、RNA的地方。
  PCR的原理是雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈,在DNA聚合酶的作用下,以單鏈為模版,根據堿基互補配對原則復制成新的單鏈,與模版配對成為雙鏈分子挎貝。在體外實驗中發現,DNA在高溫時也可以發生變性解鏈,當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。
  PCR反應一般設置20~40次循環,每一循環包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三步反應。每一循環的產物作為下一個循環的模板。每個循環的三個基本反應步驟如下:
  1、模板DNA的變性:模板DNA經加熱至94℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA產物解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應作準備。
  2、模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA經加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合。
  3、引物的延伸:溫度升到72℃左右,DNA模板-引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。重復循環變性-退火-延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2~4分鐘,2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍,到達平臺期所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。

 

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